Hoe kom je op 30,1829 °C?

basic = 64,9 + 41·(GC_count−16,4)/N; salt = 16,6·log10([Na+]/1000). N=20, GC%=50 → 10 G/C; [Na+]=50 mM. Som **30,1829** °C. Canonieke check.

Waarom zo laag voor een 20-mer van 50% GC?

50 mM zout in de log-term is 16,6·log10(0,05)≈−21,6 °C. Wallace 2+4 zou ~60 °C zeggen zonder deze zoutcorrectie. De motor is die ruwe som, geen IDT-NN.

Is 64,9 + 41·(gc−16,4)/N standaard?

Een basale lesregel. Nearest-neighbour met ΔH/ΔS is beter voor bestelling. Gebruik 30,1829 om déze implementatie te raken.

De code gebruikt max([Na+], 1) in de log. Extreme verdunning wordt afgekapt.

Niet als aparte velden. Alleen **Salt [Na+] (mM)**.

GC% uit de andere tool plakken?

Ja, als het dezelfde oligo is. 50% hier is de testdefault, niet 47,9592 van de telvoorbeeldsequentie.

Berekening van de smelttemperatuur (Tm) van de primer

Berekening van de smelttemperatuur (Tm) van de primer combineert oligolengte, GC-fractie en natrium tot één °C volgens een grove zoutgecorrigeerde regel.

Waarom Wallace 2+4 en deze Tm ruzie krijgen

De straatregel 2°C per AT en 4°C per GC geeft voor een 20-mer 50% GC ongeveer 60 °C. Deze motor start bij 64,9 + 41·(n_GC−16,4)/N en telt 16,6 log10([Na+]/1000). Bij 50 mM is die log sterk negatief, en de canonieke uitvoer is 30,1829 °C. Dat is geen ‘kapotte primer’; het is een andere vergelijking plus ijl zout. Wie 60 °C in de PCR-cycler zet op basis van Wallace en deze pagina 30 noemt, moet de methode kiezen, niet het gemiddelde.

Nederlandse labprotocollen specificeren vaak 50–60 °C annealing met primers ontworpen in IDT of Primer3 (NN). Deze pagina is tentamen- en sanity-check van déze formule. 20 nt en 50% GC en 50 mM is het anker. Langere primers tillen Tm via N in de noemer; meer GC tilt de teller; meer zout tilt de log (minder negatief).

30,1829 °C als annealing zou in veel Taq-protocollen te laag zijn. Lees het als modeloutput, niet als cycler-programma, tenzij je formule en buffer matchen.

Voordat je begint

Primer length (nt) 20. GC content (%) 50. Salt [Na+] (mM) 50. Lees Tm (°C) 30,1829.

GC% van een andere sequentie (47,9592) is een ander oligo. Niet mengen in de golden check.

Veelvoorkomende gebruiksscenario’s

Canonieke 20 / 50 / 50 → 30,1829 °C
Zout 50 versus 1000 mM (log dichter bij 0)
Lengte 20 versus 30 bij zelfde GC%
Contrast Wallace versus deze regel
Na GC%-telling van dezelfde oligo
Waarschuwing: niet blind in de cycler

Hoe deze rekenmachine te gebruiken

Vul Primer length (nt) in.
Vul GC content (%) in.
Vul Salt [Na+] (mM) in.
Lees Tm (°C).

Stap-voor-stap uitleg

Sofie reprodudeert de testdag.

Ingevulde waarden: length=20, gcPct=50, saltMm=50

Resultaat: Tm=30,1829 °C.

Sanity-check: n_GC=10; 64,9+41·(10−16,4)/20=64,9+41·(−0,32)=64,9−13,12=51,78; +16,6·log10(0,05)≈51,78−21,60=30,18. 60 °C is Wallace. 3,0 °C is een decimaal.

Takeaway: Sofie schrijft 20 nt, 50%, 50 mM, 30,1829 °C, ‘ruwe regel’.

Formule en methode

Tm = 64,9 + 41·((GC%/100)·N − 16,4)/N + 16,6·log10(max(Na,1)/1000)

Elke invoer begrijpen

length — 20. gcPct — 50. saltMm — 50. tm — 30,1829.

Aannames

Geen NN-paren, geen Mg, geen mismatches, Na-min 1 mM in de log.

Veelgemaakte fouten met Berekening van de smelttemperatuur (Tm) van de primer

30,1829 als cycler zonder buffercheck.
GC% 0,5 i.p.v. 50.
Wallace en deze Tm middelen.

Uitgewerkte voorbeelden

20, 50, 50 → 30,1829. Canonieke check.
Zelfde som basic+salt in de uitwerking.
Zelfde 50% niet 0,5. Terug tot 30,1829.

Het interpreteren van uw resultaten

Veld	Waar je op let
Tm (°C)	30,1829 bij het anker. Laag t.o.v. Wallace door 50 mM.

Hoger zout, hogere Tm in deze regel. Meer GC, hogere Tm.

Resultaten vastleggen en delen

N, GC%, [Na+], 30,1829, formuleversie, of NN elders is gebruikt.

Twintig nucleotiden, 50% GC, 50 mM Na⁺: basic ≈51,78 °C plus 16,6 log10(0,05)≈−21,6 levert 30,1829 °C. Wallace 2+4 zegt ~60 °C zonder deze zoutterm. IDT nearest-neighbour is weer anders. Kies een methode; middelen is geen methode. 50 mM is ijl t.o.v. veel PCR-buffers; hogere [Na+] tilt Tm in deze regel. Mg²⁺ en dNTP zitten niet in het veld. GC% 0,5 i.p.v. 50 is een ramp. De 47,9592% van de telvoorbeeldsequentie is een ander stuk DNA. 30,1829 °C als annealing in Taq is vaak te laag; lees het als modeloutput. max(Na,1) kapt extreme verdunning. Noteer 20 nt, 50%, 50 mM, 30,1829 °C, ‘ruwe 64,9-regel’, buffer apart. Fw en rv ΔTm elders. DMSO verlaagt Tm, zit hier niet. Hairpin/dimer: andere tools. Houd 30,1829 bij 20 / 50 / 50.

Primer3 op schoolcomputers gebruikt NN; als je verslag beide noemt, zet twee tabellen. Degenerate bases (N, Y) verlagen effectieve Tm; deze motor ziet alleen N, GC%, zout. 18-mer versus 20-mer: N in de noemer. Probe-Tm voor qPCR is strenger. Bestel oligo’s op NN, gebruik 30,1829 om déze pagina te auditen. Zout 1000 mM maakt log10(1)=0, Tm dichter bij de basic-term. Documenteer of 50 mM ‘Na-equivalent’ van je buffer is. Houd de testdag saai: 20, 50, 50, 30,1829.

Praktische tips

Eerst GC% tellen op de GC-pagina als je een fasta hebt.
Primer3/IDT voor bestelling.
Fw en rv apart; ΔTm te groot is een andere les.
DMSO verlaagt Tm; zit hier niet.

Rekenen in de praktijk

Lengte 20, GC% 50, [Na+] 50 mM geeft Tm = 30,1829 °C in deze ruwe zoutgecorrigeerde regel. Dat is lager dan veel nearest-neighbour-schattingen van dezelfde oligo. De golden is 30,1829, niet de IDT-waarde uit een catalogus. Hairpin, dimer en degenerate bases zitten er niet in. qPCR-probe-Tm zit er niet in.

GC% komt van tellen: 10 G+C op 20 mer is 50. De GC-pagina met 120/115/130/125 is 47,9592%, geen 50. Verwissel die golden niet. Zout 50 mM is lesioniciteit, geen PCR-buffer van de kit. Magnesium extra boven Na+ zit niet in deze regel.

Een primer van 18 mer bij 40% GC is een andere Tm. Annealing zet je meestal 3 tot 5 °C onder Tm — dat is protocol, geen outputveld. Twee primers in een paar horen binnen een paar graden; deze pagina rekent één oligo per run.

Noteer lengte, GC%, [Na+], en 30,1829 °C als motorcheck. OD van de oligo is Beer–Lambert. Buffer β is geen Tm. Wie 50 als 0,50 fractie GC invult terwijl het veld procent verwacht, krijgt onzin.

Synthetische primers voor een practicum in Leiden blijven een schatting tot de PCR loopt. Gradient-PCR wint van een te precies kommagetal.

Wat er misgaat in het verslag

De kit zegt annealing 55 °C. Deze regel geeft 30,1829 °C bij lengte 20, GC 50, Na+ 50 mM. Dat gat is de les: ruwe zoutregel ≠ nearest neighbour ≠ kit. Wie 30,1829 als PCR-programma flitst, krijgt geen product of alleen smeer. Gradient-PCR wint. Citeer 30,1829 als motorcheck, niet als cycler-waarheid.

Hairpin en primer-dimer zitten er niet in. Degenerate bases zitten er niet in. Probe-Tm voor qPCR zit er niet in. Magnesium boven Na+ zit er niet in. GC 50 is de oligo, niet 47,9592 van een amplicon van 490 basen.

Twee primers in een paar: twee runs, twee Tm’s, verschil in de tekst. 3 tot 5 °C onder Tm is protocolheuristiek, geen veld. Zout 50 mM is lesioniciteit.

Checklist: 20 mer, 50% GC, 50 mM Na+, 30,1829 °C, bron van de regel, en dat IDT anders kan zijn. Extra oligo 18 mer 40% GC als open vraag. Golden blijft 30,1829.

OD van de droge primer is Beer–Lambert. Buffer β is geen Tm. Wie GC als 0,50 fractie in een procentveld zet, breekt de som.

Werkcollege in Nederland

Twee groepen in Leiden krijgen dezelfde 20 mer en 50 procent GC. Groep A houdt Na+ 50 mM en moet 30,1829 °C laten zien. Groep B mag 100 mM invullen en krijgt een andere Tm; die run is geen golden. Annealing op de cycler blijft een gradient, geen kommagetal. Hairpin checken ze in andere software. Verslag: lengte, GC, zout, 30,1829 als motor, kittemperatuur apart. Wie 47,9592 van het amplicon als primer-GC gebruikt, levert de verkeerde oligo.

Beperkingen en wanneer niet te gebruiken

Geen hairpin, geen dimer, geen degenerate bases. Geen qPCR-probe-Tm.

Wanneer moet u een ander hulpmiddel zoeken?

GC-telling: DNA-GC.
PCR-template genetica: Punnett.
OD van oligo: Beer–Lambert.
Zout als ionsterkte in buffers: buffercapaciteit.