Calcolatore della temperatura di fusione del primer (Tm).
Una Tm didattica da lunghezza, GC e sale, non un nearest-neighbor completo. Canone: 20 nt, 50% GC, 50 mM → 30,1829 °C.
Perché 30 °C sul pannello non è l’annealing del kit
I termociclatori usano spesso Ta = Tm−5 con Tm da SantaLucia. Qui la formula è quella “basic + salt” del config, e a 50 mM il termine 16,6 log10(0,05) è negativo e tira giù a 30,1829 °C. Se imposti 60 °C di annealing “perché 20-mer”, stai mescolando Wallace e questo motore. Per l’audit del sito, 30,1829 è la verità del codice.
50% GC su 20 nt sono 10 G+C, in linea con un oligo tipico, non con la finestra 47,9592% da 490 basi.
Prima di ordinare oligos, valida su un tool nearest-neighbor e sul buffer del kit.
Prima di iniziare
Lunghezza, GC% dell’oligo, Na⁺ equivalente. Canone 20 / 50 / 50. Sequenza senza hairpin valutata a parte.
Casi d’uso comuni
- Audit 30,1829 °C
- Vedere l’effetto del sale
- Confrontare 18 vs 24 nt (grafico illustrativo)
- Ponte GC pagina sequenza vs oligo
- Non copiare Tm da un vendor senza formula
- Coppia forward/reverse a parte
Come utilizzare questa calcolatrice
- Primer length (nt) = 20
- GC content (%) = 50
- Salt [Na+] (mM) = 50
- Leggi Tm (°C) = 30,1829
Procedura dettagliata passo dopo passo
Pietro replica il golden primer-tm.
Tm = 30,1829 °C.
Controllo: GC 0% deve abbassare Tm; sale 1000 mM alza il log verso 0.
Cosa porta via: “20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm=30,1829 °C, formula basic+salt”.
Formula e metodo
Tm = 64,9 + 41(gc−16,4)/N + 16,6 log10(max(Na,1)/1000) gc = (gcPct/100)×N
Canone: length 20, gcPct 50, saltMm 50, tm 30.1829.
Comprendere ogni input
Primer length (nt): 20.
GC content (%): 50.
Salt [Na+] (mM): 50.
Tm (°C): 30,1829.
Ipotesi
- Un oligo, DNA/DNA, Na⁺ equivalente, niente mismatch.
Errori comuni con Calcolatore della temperatura di fusione del primer (Tm).
- GC 0,5 invece di 50
- Wallace 2+4 vs questo Tm
- Mg ignorato in un kit
- Finestra genomica come GC dell’oligo
Esempi realizzati
- Canone. 30,1829 °C.
- Primary-outputs. Stesso.
- Grafico illustrativo 20/50, 24/58, 18/39 (caption: stime esempio, non sostituiscono 30,1829).
- Sale 50 vs 1 mM. Il log cambia Tm.
- N=20, GC=50 → 10 basi G+C interne.
Interpretare i risultati
| Campo | Cosa guardare |
|---|---|
| Tm (°C) | 30,1829 nel canone. Non è Ta di un protocollo Taq senza altra fonte. |
Registrazione e condivisione dei risultati
N, GC%, [Na⁺], Tm, formula. Sequenza in FASTA a parte.
Consigli pratici
- Confronta F e R.
- Hairpin e dimer: altri software.
- Se Tm esce 30 °C e il kit dice 60, non “alzi il sale a caso”: cambi modello.
Replica sul banco e tracciabilità
Nel core PCR di un dipartimento a Firenze Quinto ripete i numeri d’oro (20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C) sullo stesso oligo forward di un amplicone da 180 pb, poi cambia un solo dato per vedere se il pannello reagisce in modo monotono. Il primo errore che cerca è impostare Ta = 60 °C copiando Wallace e ignorando 30,1829. Lo strumento di confronto è scheda del master mix e questo modello basic+salt. Il passo successivo, quando i numeri tornano, è GC della sequenza genomica a parte, nearest-neighbor del vendor a parte. Il termine 16,6 log10(50/1000) è negativo e spiega il Tm basso rispetto alle slide da 4 °C per G/C. Se il kit ha 1,5 mM Mg, la Tm vera sale: non «aggiustare» Na⁺ a 500 mM per finta. Confronta il reverse: se esce 38 °C su un altro modello, la coppia è sbilanciata indipendentemente da 30,1829.
La sessione 1 di Quinto nel core PCR di un dipartimento a Firenze non riusa il verbale precedente: annota data, operatore e selettori, perché un refresh cancella i campi di questo strumento. Se un collega ottiene un altro risultato su 20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C, confrontano etichette prima della formula. Resta un aiuto didattico sul oligo forward di un amplicone da 180 pb: confermare con il protocollo locale, non certificare una pubblicazione solo da questa pagina.
Quinto rilegge ad alta voce le unità accanto a 20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C, poi chiede se il modello usato su oligo forward di un amplicone da 180 pb è ancora quello del banco. Se non lo è, cambia strumento invece di stirare il numero. Sul quaderno restano valori, ipotesi e limite, così scheda del master mix e questo modello basic+salt e il canone si possono ripetere dopo giorni.
Nel core PCR di un dipartimento a Firenze Quinto ripete i numeri d’oro (20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C) sullo stesso oligo forward di un amplicone da 180 pb, poi cambia un solo dato per vedere se il pannello reagisce in modo monotono. Il primo errore che cerca è impostare Ta = 60 °C copiando Wallace e ignorando 30,1829. Lo strumento di confronto è scheda del master mix e questo modello basic+salt. Il passo successivo, quando i numeri tornano, è GC della sequenza genomica a parte, nearest-neighbor del vendor a parte. Il termine 16,6 log10(50/1000) è negativo e spiega il Tm basso rispetto alle slide da 4 °C per G/C. Se il kit ha 1,5 mM Mg, la Tm vera sale: non «aggiustare» Na⁺ a 500 mM per finta. Confronta il reverse: se esce 38 °C su un altro modello, la coppia è sbilanciata indipendentemente da 30,1829.
La sessione 2 di Quinto nel core PCR di un dipartimento a Firenze non riusa il verbale precedente: annota data, operatore e selettori, perché un refresh cancella i campi di questo strumento. Se un collega ottiene un altro risultato su 20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C, confrontano etichette prima della formula. Resta un aiuto didattico sul oligo forward di un amplicone da 180 pb: confermare con il protocollo locale, non certificare una pubblicazione solo da questa pagina.
Quinto rilegge ad alta voce le unità accanto a 20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C, poi chiede se il modello usato su oligo forward di un amplicone da 180 pb è ancora quello del banco. Se non lo è, cambia strumento invece di stirare il numero. Sul quaderno restano valori, ipotesi e limite, così scheda del master mix e questo modello basic+salt e il canone si possono ripetere dopo giorni.
Nel core PCR di un dipartimento a Firenze Quinto ripete i numeri d’oro (20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C) sullo stesso oligo forward di un amplicone da 180 pb, poi cambia un solo dato per vedere se il pannello reagisce in modo monotono. Il primo errore che cerca è impostare Ta = 60 °C copiando Wallace e ignorando 30,1829. Lo strumento di confronto è scheda del master mix e questo modello basic+salt. Il passo successivo, quando i numeri tornano, è GC della sequenza genomica a parte, nearest-neighbor del vendor a parte. Il termine 16,6 log10(50/1000) è negativo e spiega il Tm basso rispetto alle slide da 4 °C per G/C. Se il kit ha 1,5 mM Mg, la Tm vera sale: non «aggiustare» Na⁺ a 500 mM per finta. Confronta il reverse: se esce 38 °C su un altro modello, la coppia è sbilanciata indipendentemente da 30,1829.
La sessione 3 di Quinto nel core PCR di un dipartimento a Firenze non riusa il verbale precedente: annota data, operatore e selettori, perché un refresh cancella i campi di questo strumento. Se un collega ottiene un altro risultato su 20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C, confrontano etichette prima della formula. Resta un aiuto didattico sul oligo forward di un amplicone da 180 pb: confermare con il protocollo locale, non certificare una pubblicazione solo da questa pagina.
Quinto rilegge ad alta voce le unità accanto a 20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C, poi chiede se il modello usato su oligo forward di un amplicone da 180 pb è ancora quello del banco. Se non lo è, cambia strumento invece di stirare il numero. Sul quaderno restano valori, ipotesi e limite, così scheda del master mix e questo modello basic+salt e il canone si possono ripetere dopo giorni.
Nel core PCR di un dipartimento a Firenze Quinto ripete i numeri d’oro (20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C) sullo stesso oligo forward di un amplicone da 180 pb, poi cambia un solo dato per vedere se il pannello reagisce in modo monotono. Il primo errore che cerca è impostare Ta = 60 °C copiando Wallace e ignorando 30,1829. Lo strumento di confronto è scheda del master mix e questo modello basic+salt. Il passo successivo, quando i numeri tornano, è GC della sequenza genomica a parte, nearest-neighbor del vendor a parte. Il termine 16,6 log10(50/1000) è negativo e spiega il Tm basso rispetto alle slide da 4 °C per G/C. Se il kit ha 1,5 mM Mg, la Tm vera sale: non «aggiustare» Na⁺ a 500 mM per finta. Confronta il reverse: se esce 38 °C su un altro modello, la coppia è sbilanciata indipendentemente da 30,1829.
La sessione 4 di Quinto nel core PCR di un dipartimento a Firenze non riusa il verbale precedente: annota data, operatore e selettori, perché un refresh cancella i campi di questo strumento. Se un collega ottiene un altro risultato su 20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C, confrontano etichette prima della formula. Resta un aiuto didattico sul oligo forward di un amplicone da 180 pb: confermare con il protocollo locale, non certificare una pubblicazione solo da questa pagina.
Quinto rilegge ad alta voce le unità accanto a 20 nt, 50% GC, 50 mM Na⁺, Tm 30,1829 °C, poi chiede se il modello usato su oligo forward di un amplicone da 180 pb è ancora quello del banco. Se non lo è, cambia strumento invece di stirare il numero. Sul quaderno restano valori, ipotesi e limite, così scheda del master mix e questo modello basic+salt e il canone si possono ripetere dopo giorni.
Limitazioni e quando non utilizzarlo
Niente nearest-neighbor, niente DMSO, niente sonde LNA.
Quando cercare un altro strumento
GC, emocitometro se passi alla coltura, MOI.